近年來，隨著微生物基因組學(xué)的發(fā)展，微生物基因檢測(cè)迎來了新的機(jī)遇。2000年，Makino等已經(jīng)完成V．p的基因組測(cè)序，V．p毒力基因及特異的基因序列得到進(jìn)一步確定。根據(jù)V．p特異基因序列，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，是現(xiàn)階段檢測(cè)V，p的zui快速準(zhǔn)確的方法。目前應(yīng)用于檢測(cè)V．p的PCR方法主要有任意引物PCR（abritrarilyprimedPCR，Ap-PCR）、針對(duì)任意引物PCR、多重PCR（muhiplex-PCR）、實(shí)時(shí)PCR（Real-timePCR）。

1）任意引物PCR Matsumoto等采用任意引物PCR對(duì)V．p進(jìn)行檢測(cè)。他們針對(duì)V。p的tdh基因和trh基因一段特異的序列，設(shè)計(jì)兩條引物，
引物1：5，--GGTGCGGGAA--3，，
引物2：5，一GTTTCGCTCC一3，，
對(duì)1977～1998年所收集的227株V．p進(jìn)行PCR。通過電泳分析發(fā)現(xiàn)，1996-1998年收集的22株血清型為03：K6菌株與1996年以前收集的03：K6血清型菌株基因序列有所不同，為03；K6血清型新出現(xiàn)的變異株，并zui初出現(xiàn)在孟加拉國。這是目前zui簡(jiǎn)單的以基因?yàn)榛A(chǔ)的細(xì)菌亞分型方法。

（2）針對(duì)任意引物PCR 由于臨床分離株絕大多數(shù)含有tdh基因，因此絕大部分研究者都根據(jù)tdh設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異擴(kuò)增。1993年，Lee等根據(jù)tdh基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)36株TDH+株、89株TDH-株以及46株其他弧菌和腸道菌進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，36株TDH+株全部特異擴(kuò)增出來，其余菌株都沒有擴(kuò)增；而檢測(cè)靈敏度高，zui低檢測(cè)量可至40pgDNA，并可直接檢測(cè)糞便標(biāo)本，無需分離培養(yǎng)，方便快速。1999年，Kim等選擇toxR基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，
5’--GTCTTCTGACGCAATCGTTG--3和 5’一ATACGAGTGGTTGCTGTCATG一3’，
對(duì)14株V．p、14株其他弧菌進(jìn)行PCR。結(jié)果顯示，14株V．p都得到一條368bp的特異擴(kuò)增亮帶，而其他菌株沒有特異擴(kuò)增。此外，Venkateswaran等選擇gyrB基因設(shè)計(jì)引物對(duì)V·p進(jìn)行PCR、Cordova等選擇pR72H基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，特異性、靈敏度都很好。

（3）多重PCR 由于不是全部副溶血性弧菌都含；tdh基因或，trh。基因，所以只針對(duì)tdh或trh的單一PCR，有時(shí)會(huì)漏檢。多重PCR（multiplex-PCR）能率地檢測(cè)Vpo1994年，Bej白等針對(duì)“、tdh、trh設(shè)計(jì)不同的引物對(duì)，在同一PCR反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增tl、tdh、trh。結(jié)果顯示，所有的V。p都擴(kuò)增出“基因，tl基因是V．p特異的；54％的V．p擴(kuò)增出tdh基因；只有38．73％的V．p擴(kuò)增出trh基因；該法靈敏度高，能把log牡蠣培養(yǎng)肉湯里10～100個(gè)V．p檢測(cè)出來。與其他常規(guī)生化方法相比，多重PCR更快速，僅8h就能完成檢測(cè)，結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠，而且還可改進(jìn)成定量競(jìng)爭(zhēng)PCR，對(duì)標(biāo)本中靶序列進(jìn)行定量。

（4）實(shí)時(shí)PCR 常規(guī)PCR檢測(cè)，需要從反應(yīng)體系中吸取產(chǎn)物做電泳或Southern雜交等試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，轉(zhuǎn)移過程中易污染，造成假陽性，而且耗費(fèi)時(shí)間。1996年，Tyagi開創(chuàng)了一種實(shí)時(shí)PCR（Real-timePCP,）。實(shí)時(shí)PCR是在，PCR反應(yīng)體系中加入標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的線性Taqman．探針或莖環(huán)型熒光分子信標(biāo)探針，在墓因擴(kuò)增過程中，與產(chǎn)物雜交，此時(shí)，報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開，根據(jù)能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光而被檢測(cè)。這種方法操作簡(jiǎn)單，閉管檢測(cè)，減少污染，靈敏度高，并且可以在PCR結(jié)束或PCR過程進(jìn)行同步定性或定量檢測(cè)，面且可以進(jìn)行臨床大規(guī)?？焖贆z測(cè)。

2003年，Blackstone等針對(duì)tdh設(shè)計(jì)熒光分子信標(biāo)探針，對(duì)從牡蠣中富集的13個(gè)不同種類的菌株進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，只有含tdh的V．p才被檢測(cè)出來，特異性好，靈敏度高，能把每個(gè)純培養(yǎng)體系的1個(gè)CFU檢測(cè)出來。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)快速準(zhǔn)確，但需要價(jià)格昂貴的熒光檢測(cè)儀和熒光分子標(biāo)記探針，一般的實(shí)驗(yàn)室不能廣泛開展。分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)自1996年開創(chuàng)以來短短幾年就得到蓬勃的發(fā)展，相信隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、技術(shù)的進(jìn)步、實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀的昔及，將會(huì)得到更為廣泛的應(yīng)用。