酸）。在蛋白上樣后，帶有標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni-NTA純化介質(zhì)是Ni離子金屬螯合介質(zhì)。

蛋白過鎳柱純化的原理：Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有HIs（組蛋白）標(biāo)簽的堿性蛋白蛋白結(jié)合，組蛋白標(biāo)簽一般是6個(gè)（堿性氨基酸）。在蛋白上樣后，帶有標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以也可以與咪唑結(jié)合這時(shí)候再用咪唑洗脫，梯度洗脫，咪唑競爭性結(jié)合到硫酸鎳上，目的蛋白就被洗脫了，這時(shí)候收集浸出液，那么里面就是你要的目的蛋白，然后透析掉咪唑就行了。現(xiàn)在的柱子大多是預(yù)裝柱，也就是不用自己填柱，就是裝好鎳的傻瓜柱，也不貴，上樣，洗脫，基本兩個(gè)步驟就結(jié)束了。剩下的看你怎么處理了。

高親和Ni-NTA純化介質(zhì)（L00250）是把螯合劑（氮川三乙酸或NTA）共價(jià)偶聯(lián)到瓊脂糖介質(zhì)（4%交聯(lián)）上，然后再螯合Ni2+制備而成。NTA能夠通過四個(gè)位點(diǎn)牢固的螯合Ni2+從而減少純化過程中Ni2+泄露到蛋白樣品中。Ni-NTA純化介質(zhì)可以純化任何表達(dá)系統(tǒng)（原核，酵母，昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)）表達(dá)的天然或變性的His-標(biāo)簽蛋白。結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白可以通過低pH緩沖液、咪唑溶液甚至溶液洗脫下來。

一、NI-NTA提純操作步驟

1. 試劑和耗材準(zhǔn)備：

Bind Buffer;Wash Buffer;Elution Buffer;柱子;填料;等。

pET.wap.ns②A1; PET21空載體; 200ml誘導(dǎo)表達(dá)菌液;

2. 步驟：

2.1 50ml滅菌離心管收集菌液，用冰冷10ml PBS清洗菌液1次，離心

2.2 重懸8ml bind buffer ，冰上超聲破碎，10s間隔，至菌液不在粘稠，分裝至EP管，

2.3 4℃ 14000r/min 20min，分離上清，沉淀用5ml Buffer A+DTT重懸

2.5混勻50%NI-NTA，吸2ml 50%NI-NTA ，上柱（做2個(gè)柱，1ml NI-NTA/柱），待*沉淀（約1h），先用10ml滅菌水洗，流速：重力作用

2.6 10ml 1*Bind Buffer 進(jìn)行平衡，流速：重力作用

2.7 將準(zhǔn)備好的樣品上樣，pET.wap.ns; PET21 only分別上柱（結(jié)合時(shí)間1h-1.5h流速控制在0.1ml/min左右， EP 管，分管收集上樣后液體）

2.8 10ml 1* Bind Buffer 洗柱子（收集洗脫液10管，流速在0.3-0.4ml/min左右）

2.9 10ml 1*Wash Buffer洗柱子（收集洗脫液10管，流速在0.3-0.4ml/min左右）

2.10 5ml 1* Elution Buffer洗柱子（收集洗脫液5管）

2.11 用15ml 0.5m NaoH清洗，時(shí)間約0.5-1h（0.5ml/min）

2.12 用20%乙醇清洗，約0.5-1h（0.5ml/min）

2.13 封好加樣口，柱子存放4℃備用

洗脫液-80保藏

試劑配方：

10×NI-NTA Bind Buffer （天然條件Binding/Lysis Buffer，100mL）

50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O（MW 156.01g/mol）

300mM NaCl 17.53g NaCl（MW58.44g/mol）

10mM imidazole 0.68g咪唑（MW68.08g/mol）

NaOH調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾

10×NI-NTA Wash Buffer （天然條件Wash Buffer，100m L ）

50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O （MW 156.01g/mol）

300mM NaCl 17.53g NaCl（MW58.44g/mol）

20mM imidazole 1.36g咪唑（MW68.08g/mol）

NaOH調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾

10×NI-NTA Elution Buffer（天然條件Elution Buffer.，100m L）

50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O （MW 156.01g/mol）

300mM NaCl 17.53g NaCl（MW58.44g/mol）

250mM imidazole 17.0g咪唑（MW68.08g/mol）

NaOH調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾

1X PBS （0.1M PBS, pH 7.4）:

137mM NaCl（MW58.44g/mol） --------------------------------------------- 8g

2.7mMKCl（MW74.55g/mol）----------------------------------------------- 0.2g

10mMNa2HPO4 （anhydrous） （MW141.98g/mol）----------------------- 1.42 g

2mMKH2PO4 （anhydrous） （MW136.09g/mol） ------------------------- 0.27g

Distilled water ----------------------------------------------------------- 1000 ml

Mix to dissolve and adjust pH to 7.4（ HCl ,調(diào)節(jié)）

高壓滅菌后，Store this solution at room temperature. Dilute 1:10 with distilled water before use and adjust pH if necessary.

二、Ni-NTA 常見問題及建議

純化的組分中沒有His 標(biāo)簽的蛋白?

首先確定是蛋白沒有掛上柱還是蛋白沒有被洗脫下來。若His 標(biāo)簽蛋白沒有與柱結(jié)合：

可能原因：超聲的功率不對（ 太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放）

策略：改變超聲功率，并在超聲前加入

可能原因：樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確：

策略：檢測pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份。確保在溶液中鰲合劑或強(qiáng)還原劑的濃度及咪唑的濃度不是太高。

可能原因：標(biāo)簽暴露不*

策略：在變性條件下（ 用4-8 M 脲，或4-6 M 鹽酸胍） 進(jìn)行純化。

可能原因：His 標(biāo)簽丟失

策略1：WB 檢查His 是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變His-tag 的位置（C- 端或 N- 端），必要時(shí)增加His 個(gè)數(shù)。

策略2：孵育的時(shí)間不夠，降低流速和增加孵育的時(shí)間。

策略3：改變螯合的金屬離子，尋找到*的結(jié)合金屬離子。

Ni2+ 通常是從宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù)6×His 標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的金屬離子。也是一般zui常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受幾種因素影響，包括長度、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不用Ni2+。

His 標(biāo)簽蛋白若沒有洗脫下來，請依次檢查：

可能原因：洗脫條件太溫和（標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強(qiáng)）

策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出*的洗脫條件。

可能原因：降低pH 的方法洗脫的，因?yàn)槿?/span>pH 低于3.5，會導(dǎo)致鎳離子脫落

策略：改變洗脫辦法，咪唑競爭性洗脫

可能原因：蛋白已沉淀在柱上

策略：減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl 的濃度，或在變性條件（ 去折疊） 下洗脫（ 用4-8 M 脲，或4-6 M 鹽酸胍）。

可能原因：非特異性疏水或其他相互反應(yīng)

策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl 的濃度。

His 標(biāo)簽蛋白洗脫后雜帶較多，什么原因? 如何優(yōu)化?

高純度的蛋白是純化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也會帶有HIS，所以經(jīng)常會出現(xiàn)HIS 標(biāo)簽蛋白洗脫后有一些雜帶，可能的原因和優(yōu)化的方法如下：

可能原因：蛋白酶部分降解了標(biāo)簽蛋白

策略：請?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?/span>

可能原因：雜質(zhì)對鎳離子有更高的親和性

策略1：咪唑濃度必須優(yōu)化，以確保高純度（ 宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的低結(jié)合） 和高產(chǎn)率（ 標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合） 之間的*平衡。分步或者線性洗脫摸索出*的咪唑結(jié)合和清洗濃度;在樣品中加入與結(jié)合緩沖液同樣濃度的咪唑;咪唑的梯度不大（20 個(gè)或更多的柱床體積），可能分離出有相似結(jié)合強(qiáng)度的蛋白

策略2：篩選的緩沖液條件，NaCl 濃度，pH 的范圍都需要進(jìn)行篩選。對于單一目標(biāo)蛋白在進(jìn)行緩沖液篩選時(shí)，將緩沖液、鹽、甘和還原劑設(shè)計(jì)成不同的混合配方來進(jìn)行優(yōu)化。

策略3：若以上優(yōu)化的條件都不能去除雜質(zhì)蛋白，需要考慮多步純化的思路，如利用Strep 標(biāo)簽進(jìn)行兩步純化或采用Subtractive method 進(jìn)行純化。

可能原因：雜質(zhì)和標(biāo)簽蛋白結(jié)合在一起

策略：在超聲破碎細(xì)胞之前加入去垢劑或者還原劑;增加去垢劑的濃度（ 2% Triton X-100 or 2% Tween 20）;或者在Wash buffer 中增加甘的濃度（50%） 減少非特異性的相互反應(yīng);考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子。

可能原因：洗滌不充分

策略：增加洗滌的次數(shù)，使洗滌充分。

蛋白過鎳柱純化步驟中，因?yàn)楝F(xiàn)在很多都是預(yù)裝柱，也就不用自己裝填料了，一般的蛋白純化也就只有上樣和洗脫兩個(gè)步驟了。需要注意的是純化過程中流速不應(yīng)該過快。